Nueva Técnica Visualiza Células Enteras En Superresolución

El nuevo método de obtención de imágenes pone al alcance la microscopía de súper resolución

Los investigadores utilizaron su método SDC-PAINT para visualizar la red de filamentos de microtúbulos citoesqueléticos (verde) y su proximidad con dos proteínas adicionales llamadas TOM20 (rojo) y HSP60 (azul). Cada imagen muestra las proteínas en un plano diferente de la célula comenzando desde la parte superior, y las imágenes ampliadas en la parte inferior comparan la resolución alcanzada con SDC-PAINT (izquierda) con la posible con microscopía confocal convencional (derecha). Crédito: Florian Schueder, MPI / LMU

Los biólogos celulares tradicionalmente usan tintes fluorescentes para etiquetar y visualizar las células y las moléculas dentro de ellas bajo un microscopio. Con diferentes métodos de microscopía de súper resolución, incluso pueden iluminar moléculas individuales y ver sus complejas interacciones entre sí. Sin embargo, el hardware de microscopía requerido para hacer esto es altamente especializado, costoso y requiere que los operadores tengan habilidades únicas; por lo tanto, estos microscopios son relativamente raros en los laboratorios de todo el mundo.

Ralf Jungmann, Ph.D., alumno del Instituto Wyss y actualmente profesor de Bioquímica en la Universidad Ludwig Maximilian (LMU) y el Instituto Max Planck (MPI) en Alemania y miembro de la Facultad Central del Instituto Wyss Peng Yin, Ph.D . hemos estado desarrollando ADN -PAINT, una poderosa tecnología de imágenes moleculares que involucra interacciones transitorias ADN-ADN para localizar con precisión tintes fluorescentes con superresolución. Sin embargo, aunque los investigadores demostraron el potencial de DNA-PAINT al visualizar biomoléculas individuales como proteínas en células fijas a una distancia cercana fija, la tecnología aún no podía investigar moléculas en el interior de las células.

Ahora, los equipos de Jungmann y Yin informan conjuntamente una solución para superar esta limitación. En su nuevo estudio, adaptaron la tecnología DNA-PAINT a microscopios confocales, que son ampliamente utilizados por los investigadores en los laboratorios de biología celular para obtener imágenes de células completas y tejidos más gruesos a menor resolución. El equipo de MPI / Wyss Institute demuestra que el método puede visualizar una variedad de moléculas diferentes, incluidas combinaciones de diferentes proteínas, ARN y ADN en toda la profundidad de las células completas en superresolución. Publicado en Nature Communications, el enfoque podría abrir la puerta a estudios detallados de localización de una sola molécula en muchas áreas de la investigación celular.

El enfoque DNA-PAINT une una “cadena de anclaje” de ADN a la molécula de interés. Luego, una “cadena de generación de imágenes” de ADN marcada con un colorante con una secuencia complementaria se une transitoriamente al ancla y produce una señal fluorescente, que se produce como un evento de parpadeo definido en sitios moleculares individuales. Debido a que esta “frecuencia de parpadeo” se puede sintonizar con precisión, se pueden distinguir moléculas que están a solo nanómetros de distancia entre sí, en el extremo de mayor resolución de la superresolución.

“Nuestro nuevo enfoque, SDC-PAINT, integra las versátiles capacidades de superresolución de DNA-PAINT con las funciones de corte óptico de los microscopios confocales. Por lo tanto, creamos los medios para explorar toda la profundidad de una célula y visualizar las moléculas dentro de ella a escala nanométrica ”, dijo Jungmann. El equipo trazó un mapa de la presencia de diferentes combinaciones de proteínas dentro de células completas y luego fue más allá. “Al diversificar nuestros enfoques de etiquetado, también visualizamos diferentes tipos de biomoléculas individuales en el núcleo que contiene cromosomas, incluidas secuencias en el ADN, proteínas unidas al ADN o la membrana que encierra el núcleo, así como ARN nucleares”, agrega Yin. quien también es codirector de la Iniciativa de Robótica Molecular del Instituto Wyss y profesor de Biología de Sistemas en la Escuela de Medicina de Harvard.

Microscopía de súper resolución

SDC-PAINT puede visualizar con precisión la distribución de las estructuras productoras de energía de la célula conocidas como mitocondrias al combinar señales de fluorescencia de alta resolución de una proteína en sus membranas externas (en rojo) y una proteína en su lumen interior (en verde). El GIF de la izquierda muestra secciones consecutivas tomadas a través del espacio 3D de las celdas en el área delineada con el pequeño rectángulo en la imagen de la derecha. Crédito: Florian Schueder, MPI / LMU

En principio, los microscopios confocales utilizan los denominados poros para eliminar la fluorescencia desenfocada no deseada de los planos de imagen por encima y por debajo del plano focal. Al escanear la muestra, plano tras plano, los investigadores pueden recopilar las señales de fluorescencia deseadas emitidas por los colorantes unidos a moléculas en toda la profundidad. Específicamente, el equipo del MPI / Wyss Institute desarrolló la técnica para microscopios “Spinning Disk Confocal” (SDC) que detectan señales de fluorescencia de un plano completo de una sola vez al detectarlas a través de un disco giratorio con múltiples orificios. Además, “para lograr la superresolución 3D, colocamos una lente adicional en la ruta de detección, lo que nos permite archivar una resolución limitada por subdifracción en la tercera dimensión”, dijo el primer autor Florian Schueder, un estudiante de posgrado que trabaja con Jungmann y que también trabajó con el equipo del Instituto Wyss de Yin como parte de su tesis de maestría.

“Esta adición puede ser fácilmente personalizada por los fabricantes de microscopios SDC; por lo que básicamente implementamos microscopía de superresolución sin complejos cambios de hardware en los microscopios que generalmente están disponibles para los biólogos celulares de todos los lugares de investigación biomédica. Por lo tanto, el enfoque tiene el potencial de democratizar la obtención de imágenes de superresolución de células y tejidos completos ”, dijo Jungmann.

Nuevo método de obtención de imágenes para microscopía de superresolución

La imagen de la izquierda muestra cómo los investigadores utilizaron SDC-PAINT para investigar el núcleo envolvente del ADN de una célula con la membrana nuclear en verde, una proteína asociada al cromosoma en rojo y una proteína que controla diferentes procesos nucleares en azul. En la imagen de la derecha, se demuestra con el enfoque la localización de un ARN específico llamado Xist en diferentes regiones del cromosoma X. Crédito: Brian Beliveau, Sinem Saka, Hiroshi Sasaki, Instituto Wyss de la Universidad de Harvard

“Con este importante avance, la microscopía de superresolución y DNA-PAINT podrían volverse más accesibles para los investigadores biomédicos, acelerando nuestros conocimientos sobre la función de las moléculas individuales y los procesos que controlan dentro de las células”, dijo el director fundador del Instituto Wyss, Donald Ingber, MD, Ph.D., quien también es profesor Judah Folkman de Biología Vascular en HMS y el Programa de Biología Vascular en el Boston Children’s Hospital, así como profesor de Bioingeniería en la Escuela de Ingeniería y Ciencias Aplicadas John A. Paulson de Harvard (SEAS).

Otros autores del estudio son miembros pasados ​​y presentes del grupo de Yin, incluidos Juanita Lara-Gutiérrez; Brian Beliveau, Ph.D .; Sinem Saka, Ph.D .; y Hiroshi Sasaki, Ph.D .; y Johannes Woehrstein, Maximilian Strauss y Heinrich Grabmayr, Ph.D., que trabajan con Jungmann. El estudio fue financiado por subvenciones del Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica de la Universidad de Harvard, el Programa Emmy Noether de la Fundación Alemana de Investigación, el Consejo Europeo de Investigación, el Centro de Nanociencia de LMU, la Sociedad Max Planck y la Fundación Max Planck, los Institutos Nacionales de Salud. y la Oficina de Investigaciones Navales.

Publicación: Florian Schueder, et al., “Imágenes multiplexadas en 3D de superresolución de células enteras utilizando microscopía confocal de disco giratorio y DNA-PAINT”, Nature Communications 8, número de artículo: 2090 (2017) doi: 10.1038 / s41467-017-02028 -8

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